Моноклоналды антиденелер курстық жұмыс
МАЗМҰНЫ
КІРІСПЕ 5
1.Әдеби шолу 7
1.1 Зерттеу жадығаттары мен әдістері 7
1.1.1 Зерттеу жадығаттары мен әдістері 7
2. Зерттеу нәтижелері 9
2.1 Зерттеу нәтижелері 9
2.1.1 Туберкулез антигенін алу және олардың сипаттамасы 9
2.2.2 Mycobacterium tuberculosis ультрадыбысты дезинтеграты мен липолосахаридті антигенінің моноклоналды антиденелерді өндіретін гибридті жасушалар штамдарын алу 9
2.2.3 Адам туберкулезінің серологиялық балауында моноклоналды антиденелерді қолдана отырып ИФТ және ИФР әдістерін қою 15
ҚОРЫТЫНДЫ 22
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР 24
Анықтама
Жұмыс түрі: Курстық жұмыс
Жұмыс көлемі: 24 бет
Пәні: Соңғы қосылған курстық жұмыстар
-----------------------------------------------------------------------------------
КУРСТЫҚ ЖҰМЫСТЫҢ ҚЫСҚАРТЫЛҒАН МӘТІНІ
МАЗМҰНЫ
КІРІСПЕ 5
1.Әдеби шолу 7
1.1 Зерттеу жадығаттары мен әдістері 7
1.1.1 Зерттеу жадығаттары мен әдістері 7
2. Зерттеу нәтижелері 9
2.1 Зерттеу нәтижелері 9
2.1.1 Туберкулез антигенін алу және олардың сипаттамасы 9
2.2.2 Mycobacterium tuberculosis ультрадыбысты дезинтеграты мен липолосахаридті антигенінің моноклоналды
2.2.3 Адам туберкулезінің серологиялық балауында моноклоналды антиденелерді қолдана отырып
ҚОРЫТЫНДЫ 22
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР 24
Анықтама
Микобактерия антигендері. Жұмыс барысында Mycobacterium tuberculosis H 37RV шт.,
Туберкулез антигендерін алу. M.tuberculosis – тің ақуызды – полисахаридті
Алынған Mycobacterium tuberculosis антигендерінің электрофорезі V.K. Laemmli әдісімен, 7%
Моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушаларды алу технологиясы. M
Қысқартулар мен белгілеулер
Mycobacterium tuberculosis H 37RV шт –микобактериум туберкулесистің H 37RV
M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M.
КІРІСПЕ
Тақырыптың өзектілігі: Адам туберкулезі аса маңызды медициналық – әлеуметтік
Қазақстан қолайсыз эпидемиологиялық жағдайдағы мемлекеттердің қатарына жатады. Қазіргі таңда
Қазіргі кезде республикамызда мультирезистентті созылмалы туберкулезді (туберкулездің дәріге төзімді
Туберкулездің диагностикасын жетілдіру белгілі дәстүрлі әдістердің сезімталдығын жоғарылатуға және
Cоған қарамастан туберкулездің иммунологиялық зерттеулер унификациясы және оны қолданудың
Осындай өзекті мәселені шешу жолы біздің көзқарасымыз бойынша моноклоналды
Жұмыстың басты мақсаты: Mycobacterium tuberculosis – ке телімді моноклоналды
Осы мақсатқа жету үшін келесі міндеттер қойылды:
Микобактерия қоздырғыштарынан липополисахаридті және ақуызды антигендерін бөліп алып, олардың
Туберкулез қоздырғышының антигендеріне телімді моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушалар
Алынған моноклоналды антиденелердің иммундыхимиялық қасиеттеріне сипаттама беру.
ИФТ – дың “бәсекелі” қойылымында моноклоналды антиденелерді негізінде, қосымша
Жұмыстың ғылыми жаңалығы. Алғаш рет Mycobacterium tuberculosis – тің
Қазақстан Республикасы Әділет министрлігінің зияткерлік меншік құқыңы жөніндегі Комитетінің
Қорғауға шығарылған негізгі қағидалар.
Mycobacterium tuberculosis – тің ақуызды және липополисахаридті антигенін алу.
Mycobacterium tuberculosis штамының ультрадыбысты дезинтегратымен иммунделген BALB/c тышқандарының көк
Моноклоналді антиденелер негізінде адам туберкулезін балауға арналған “бәсекелі” иммунды
ӘДЕБИ ШОЛУ
Зерттеу жадығаттары мен әдістері
1.1.1 Зерттеу жадығаттары мен әдістері
Зерттеу жұмыстары 2006 – 2009 жж. РМК “Қазақстан Республикасы
Микобактерия антигендері: Жұмыс барысында Mycobacterium tuberculosis H 37RV шт.,
Туберкулез антигендерін алу. M.tuberculosis – тің ақуызды – полисахаридті
Алынған Mycobacterium tuberculosis антигендерінің электрофорезі V.K. Laemmli әдісімен, 7%
Моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушаларды алу технологиясы. M tuberculosis
Жұмыста қолданылған жануарлар. Жұмысты орындау барысында келесі жануарлар түрлері
BALB/c тышқандары Mycobacterium tuberculosis – тің УДД антигенімен иммунделіп,
Зертханалық ақ тышқандар құрсақ қуысынан макрофагтарды бөліп алу үшін
Қолданылған иммунологиялық реакциялардың көрсеткіштері Т.С. Сайдулдин (1992), Г.Ф. Лакин
Зерттеу нәтижелері
2.1 Зерттеу нәтижелері
2.1.1 Туберкулез антигенін алу және олардың сипаттамасы
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium бактериалды массасынан ЛПС
Ультрадыбысты дезинтеграция (УДД) әдісімен алынған ақуызды антигеннің көрсеткіші келтірілген
Полиакриламидті гелде натрий додецилсульфатының қатысуымен жүргізілген электрофорез әдісімен M.
Зерттеу жұмысымыздың келесі кезеңінде туберкулезге шалдыққан адамның қан сарысуының
Жұмысты орындау барысында M. Tuberculosis липополисахаридтері мен ультрадыбысты дезинтеграттың
2.2.2 Mycobacterium tuberculosis ультрадыбысты дезинтеграты мен
BALB/c тышқандарын иммундеудің бірінші күні құрсақ ішіне әрбір антигенді
Кесте 1 – Иммунды ферменттік талдаудың жанама тәсілімен BALB/c
Тышқандар топтары Иммундеуде қолданылған антигендер Телімді антиденелер титрі
Mycobacterium tuberculosis УДД Mycobacterium tuberculosis ЛПС
I M. tuberculosis УДД 1:25600 1:100
II M. tuberculosis ЛПС 1:400 1:12800
Ескерту: УДД – ультрадыбысты дезинтеграт ЛПС - липополисахарид
1 – ші кестеден көргеніміздей, ұқсас антигенге қарсы Mycobacterium
Сонымен, біз колданған Мусоbасtеrіит tиbесиlоsis УДД антигені мен Мусоbасtеrіит
Тышкандардың әрбір антиденелер титрі тобынан максималды болған жануарлар таңдалып
Гибридомалардың телімді антиденелерді өндіретіндігін өскен ортаның аздап сарғаюы байқалганда
Иммунды спленоциттер мен миелома жасушаларын будандастыру нәтижелері 2-ші кестеде
Кесте 2 - Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің ультрадыбысты дезингегратымен егілген ВАІВ/с
Будандастыру реті Иммунеуде қолданрылған антигендер Миелеломды жасуша мен спленоциттердің
саны %
1 M. tuberculosis УДД 1:10 384 90 23,4
2 M. tuberculosis ЛПС 1:10 384 60 15.6
Ескерту: УДД – ультрадыбысты дезинтеграт ЛПС - липополисахарид
2-ші кестеден көргеніміздей, будандастырудың нәтижесінде М. tиbеrсиlоsіs-тің ультрадыбысты дезинтеграты
Жасуша гибридизациясының біз кол жеткізген жоғары дәрежесі ИФТ-да телімді
Кесте 3 - Гибридомалардың өсінді сұйықтығын ИФТ-да тестілеу нәтижелері
Антигендер Түзілген гибридомалардың саны Антигендерге телімді антиденелерді түзетін клондар
саны (%)
M. tuberculosis УДД 90 15 16,6
M. tuberculosis ЛПС 60 10 16,4
Ескерту: УДД – ультрадыбысты дезинтеграт ЛПС - липополисахарид
3-ші кесте көрсеткіштері бойынша будандастыру нәтижесінде пайда болған 90
Моноклоналды антиденелерді тұрақты синтездейтін клондарды іріктеу мақсатында алынған гибридомалардың
Кесте 4 - Гибридті жасушаның скрининг нәтижелері
№ Гибридомалардың атауы Гибридті жасушалардың антиденелік белсенділігі
1 2 3 4 5
Mycobacterium tuberculosis УДД
1 1Д6 1:4 1:4 1:8 1:16 1:32
2 1F9 1:8 1:8 1:16 1:16 1:32
3 1G3 1:16 1:32 1:32 1:64 1:64
4 3Д6 1:4 1:8 1:8 1:16 1:16
5 1Д7 1:8 1:16 1:16 1:32 1:64
6 2G10 1:2 1:2 1:4 1:4 1:8
7 3Д9 1:2 1:4 1:4 1:4 1:8
8 2G5 1:8 1:8 1:8 1:8 1:16
9 2E6 1:4 1:4 1:4 1:8 1:16
10 2C10 1:16 1:16 1:32 1:64 1:32
11 3B4 1:8 1:8 1:16 1:16 1:32
12 3C5 1:4 1:4 1:2 1:8 1:16
13 1C8 1:4 1:8 1:8 1:16 1:32
14 1Д10 1:4 1:4 1:8 1:16 1:32
15 2B7 1:4 1:4 1:8 1:16 1:32
16 1C2 1:4 1:2 1:2 1:2 -
17 1B3 1:4 1:2 1:2 1:2 -
18 2Д3 1:4 1:4 1:4 1:2 -
19 2E10 1:4 1:2 1:2 1:2 -
20 3B8 1:4 1:4 1:4 1:4 -
21 2G7 1:8 1:4 1:4 1:2 - 22
23 1B9 1:4 1:4 1:2 1:2 -
24 1F7 1:4 1:2 1:2 1:2 -
25 2G9 1:8 1:8 1:4 1:2 -
4-ші кесте мәліметтері бойынша М tиbегсиlоsіs-тін УДД антигеніне телімді
М. tuberculosis-тің ЛПС антигенге қарсы антиденелерді түзетін гибридомалардың барлығын
Сонымен, әрі қарайғы жұмыстарымызда тұракты антиденелерді түзуші клондарды М.
1Д7, 2С10 және 103 жасушалар клондары анағұрлым белсенді және
Кесте 5 - Моноклоналды антиденелерді түзетін гибридома жасушаларын клондау
Клон атауы Субклондар саны МКА клон – өнімдерінің саны
1Д7 40 27 67,5 1:16-1:128 1Д7А2
2С10 25 20 80,0 1:8-1:32 2C10F3
1G3 38 30 78,9 1:32-1:256 1G3H2
Бұл ретте бастапқы ата-аналық жасушадан гибридомдардың позитивті субклондарының шығуы
Гибридома штамдарының өнімділігі 3-4 тәулік бойы өсірілген гибридомалардың өсінді
Келесі зерттеуде асцит сұйыктығының моноклоналды антиденелерінің белсенділігі мен телімділігі
Кесте 6 - Моноклоналды антиденелердің белсенділігі мен телімділігін иммунды
Микобактериялардың тұтас жасушалары МКА телімділігі
1Д7А2 2С10F3 1G3H2
M. tuberculosis 1:204800 1:204800 1:102400
M. bovis 8 1:400 1:800 1:400
M. intracellulare ТН ТН ТН
M. avium TH TH TH
M. scrofulaceum TH TH TH
M. kansassii TH TH TH
M. fortuitum TH TH TH
M. phlei TH TH TH
Ескерту: TH – теріс нәтижесі
6-шы кесте мәліметтері бойынша 1Д7А2, 2С10FЗ және 1G3Н2 гибридом
Басқа микобактериалды антигендерге қатысты МКА телімділігін талдауда 1Д7А2, 2С10F3
Моноклоналды антиденелердің класын анықтау тышкандардың иммуноглобулиндеріне ІgМ, ІgА, IgG,
Аталмыш тәсілді жүргізу барысында монотелімді қан сарысуы мен МКА
Аффинділік байланыс константын анықтау көмегімен сандык түрде өлшенуі мүмкін.
Кесте 7 - Гибридом штаммдары МКА иммундыхимиялык касиеттері
Гибридом штамдары Антидене кластары және класс тармақтары Байланысу константысы
дақылда мкг/мл асцитте мг/мл
1Д7А2 IgG 1 1х10‾8 10,0 8,0 20,8
2C10F3 IgG 1 1х10_9 10,0 8,0 20,8
1G3H2 IgG 1 1*10_7 5,0 4,0 20,8
Иммуноглобулинді препараттарының тазалығын зерттеу мақсатында аммоний сульфатымен тазартылған МКА
Электрофорез нәтижесінде МКА барлык түрлері молекулалык салмақтары 60 кДа
Сонымен, 1Д7А2, 2С10FЗ және 1G3H2 штамдарының түзегін МКА мен
2.2.3 Адам туберкулезінің серологиялық балауында моноклоналды антиденелерді колдана отырып
Осы зерттеудің максаты адамдар қан сарысуындағы туберкулезге қарсы антиденелерді
Туберкулез микобактерияларына телімді антиденелерді ИФТ «жанама» қойылымымен анықтау сызбасы
– ші кезеңде -антиген катты фазага адсорбцияланады.
2 – ші кезеңде - зерттеуге алынған материал кұрамындағы
3-ші кезең - ферментпен танбаланған антиденелер (конъюгат) «антиген+ антидене»
4-ші кезең - субстрат ерітіндісінің көмегімен «антиген+антидене+ конъюгат» иммунды
5-ші кезең - реакция нәтижесін немесе ферменттік реакция өнімдерінің
ИФТ-дың «бәсекелі» койылымында антиген қатты фазаға адсорбцияланған моноклоналды антиденелермен
Әрбір кезеңнің оңтайлы параметрлерін анықтау үшін ИФТ-ды бес рет
Зерттеу нәтижелері бойынша ИФТ-дың жеткілікті сезімталдығын камтамасыз ететін Мусоbacterium
Біз иммунды ферментті талдауда бірінші антидене мен антиген ретінде
Антиген-антидене реакциясындағы тепе-теңдік 2 сағат инкубацияланғаннан кейін пайда болып,
Түрге қарсы пероксидазалық конъюгат пен антиген+антидене кешенінін байланысын бағалау
Біз антитүрлік конъюгаттардың (флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) «Сигма» шығарған (ФРГ)
Кесте 8 - ФИТЦ-пен МКА-ді конъюгациялау шарттары
Клон атауы МКА 1 мг-ғы ФИТЦ мөлшері
5 – 10 мкг 20 – 25 мкг 30
1Д7 Өте әлсіз жарқырау Әлсіз жарқырау Біркелкі жарқырау
2С10 Өте әлсіз жарқырау Әлсіз жарқырау Біркелкі жарқырау
1G3 Өте әлсіз жарқырау Әлсіз жарқырау Біркелкі жарқырау
Кестеден көргеніміздей 1 мг МКА-де ФИТЦ-тің анағұрлым үйлесімді мөлшері
Иммунды флюоресцентті конъюгатты қолдану барысында телімсіз байланысудың (боялу) анағұрлым
Иммунды флюоресцентті реакциясының тікелей әдісін қажетті жағынды микобактериядан заттық
Туберкулезге шалдыққан науқастардан алынған биологиялық материалдың барлығы 10 сынамасы
Кесте 9 - Туберкулезге алынған сынамаларды зерттеу нәтижелері
Сынамалар Зерттеу әдістері
Бактериоскопия Бактериология ИФР “бәсекелі” ИФТ
1 + + + +
2 + + + +
3 + + + +
4 + + + +
5 + + + +
6 + + + +
7 + + + +
8 + + + +
9 + + + +
Теріс бақылау - - - -
Ескерту: (+) – оң реакция, (-) – теріс реакция
Кесте мэліметтері бойынша иммунды флюоресцентті реакциясы мен иммунды ферментті
Моноклоналды антиденелерді қолдана отыра жүргізілген ИФТ және ИФР әдістері
Туберкулезге шалдыкқан адамдардын қан сарысуындағы туберкулезге қарсы антиденелерді анықтау
Жұмыс барысында 120 туберкулезге шалдыққан адамдардың кан сарысуы және
М. tuberculosis -тің ақуызды антигенінің концентрациясы 10 мкг/мл тең
Сау адамдар мен туберкулезге шалдыққан адамдардың кан сарысуындағы туберкулезге
Кесте 10 - М tuberculosis-тің ақуызды антигенімен МКА мен
Қан сарысу Қан сарысу сұйылтымы Трипликаттар Ортақ арифметикалық саны
Науқас 1:5 0,217 0,240 0,223 0,226 33,7 66
1:25 0,279 0,269 0,275 0,274 40,9 59
1:125 0,373 0,398 0,351 0,374 55,9 44
Сау 1:5 0,650 0,623 0,667 0,646 96,5 3,4
1:25 0,622 0,635 0,657 0,638 95,3 4,6
1:125 0,654 0,678 0,690 0,667 99,7 0,2
Тікелей реакциясы (Антиген + МКА)
0,678
0,658
0,672
0,669
100
Тікелей реакциядағы трипликат тығыздығының орташа көрсеткішін (100%) деп қабылдап,
Статистикалык өндеуді Стьюдент өлшемі бойынша жүргіздік (1:25 сұйылтымында алынған
Кесте 11 — М.tuberculosis-тің ақуызды антигенімен МКА туберкулезге қарсы
Көрсеткіштері Туберкулезбен ауыратын науқас
n=120 Сау адамдар
n=80
Ингибиция пайызы М-42,1
М-1,8 М-17,1
М-1,4
Ауру адамдармен сау адамдардың көрсеткішін салыстыру кезіндегі статистикалық айырмашылығы
Кестеде көрсетілгендей, туберкулезге шалдыққан адамдар мен сау адамдардың ингибициясының
Пайыздық ингибицияның көрсеткіші 50%-ға жетсе немесе одан жоғары болған
120 туберкулезге шалдыққан адамның ішінен 74 наукастың қан сарысуы
Сонымен, алынған нәтижелер сау адамдар мен туберкулезге шалдыққан адамдардың
Сау адамдар реакциясының оң нәтиже беруін халык арасында инфицирленген
Моноклоналды антиденелер негізінде ИФТ «жанама» тәсілін ИФТ-ың «бәсекелі» тәсілімен
Кесте 12 - МКА негізінде «бәсекелі» ИФТ-дың диагностикалық кұндылығын
Зерттеу тобы Сынама саны Оң нәтиже көрсеткен сынама саны
Бактериоскопия Бактериология ИФТ “жанама” ИФТ “бәсекелі”
Оң нәтиже % Оң нәтиже % Оң нәтиже %
Науқас 120 70 58,3 74 78,3 87 72,5 74
Сау 80 2 2,5 2 2,5 15 12,5 4
12-ші кестеде көрсетілген, туберкулезді зерттеуде бір уакытта ИФТ екі
120 он үлгілерде «бәсекелі» ИФТ-дың бактериология әдісімен нәтижелердің сәйкес
Зерттеу нәтижелері «бәсекелі» ИФТ әдістің телімділігі «жанама» ИФТ-ға карағанда
Сонымен алынған моноклоналды антиденелер адам туберкулездің серологиялык балауында колдануға
ҚОРЫТЫНДЫ
Атқарыған зерттеу жұмыстарының нәтижесінде Мусоbacterium tuberculosis-тің ақуызды антигеніне телімді
Курстық жұмыстың алынған нәтижелері бойынша мынадай қорытындылар шығарылды:
О. Westphal бойынша сулы-фенолды әдісімен және ультрадыбысты дезинтеграция арқылы
Иммундеудің екі апталык сызбасын колдана отыра егілген ВАLВ/с тышқандарының
Гибридомдық технология әдісімен 3 штам алынды. 1Д7А2, 2С10F3 және
Гибридома штамдарын синтездік тышкандардың кұрсақ қуысында өсіру барысында алынған
Бәсекелі ИФТ қойылымында 120 туберкулезге шалдықкан адамның ішінен 74
120 он үлгілерде «бәсекелі» ИФТ-дың бактериология әдісімен нәтижелердің сәйкес
Жұмыста койылган міндеттер толықтай орындалды. Моноклоналды антиденелер негізіндегі ИФТ-дың
Осы салада қол жеткізілген жоғары жетістіктермен салыстыра отыра алынған
Алынған нәтижелердің талдауы көрсеткендей, берілген жұмыста қойылған міндеттер толығымен
Тәжірибелер 2006-2009 жылдар аралығында зертханалык жағдайда Қазакстан Республикасы Ұлттык
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР
Ахаева А.А., Муканов К.К., Бакирова Г.А. Получение гибридом продуцентов
Бакирова Г.А., Ахаева А.А., Муканов К.К., Акибеков О.С., Жунусова
Муканов К.К., Бакирова Г.А., Ахаева А.А., Булашев А.К., Жунусова
Ахаева А.А., Муканов К.К., Бакирова Г.А., Шенжанов К.Т., Жунусова
Бакирова Г.А., Муканов К.К., Шенжанов К.Т., Ахаева А.А., Сарина
Ахаева А.Ә. Мусоbacterium tиberculosis қоздырғышынан алынған гибридома штамдарынан түзілетін
Ахаева А.А., Бакирова Г.А., Муканов К.К., Мукантаев К.Н., Раманкулов
Авторское свидетельство №22178, КZ, А 22178 С12N 5/00, «Штамм
3
